Биологические индикаторы в современной практике стерилизации

Биологические индикаторы (БИ) являются незаменимыми инструментами для подтверждения эффективности процессов стерилизации в здравоохранении и промышленности. Эволюция систем автономных биологических индикаторов (АБИ) позволила осуществлять более быстрый, надежный и стандартизированный мониторинг циклов стерилизации. В данной работе рассматриваются научные принципы, лежащие в основе технологии биологических индикаторов, с особым акцентом на системы быстрого считывания, демонстрацию уровня гарантии стерильности (SAL) 10⁻⁶, и практическое применение при рутинном мониторинге стерилизации. 

На протяжении всей работы продуктовые линейки автономных биологических индикаторов Terragene Bionova®, включая модели со временем считывания всего 7 секунд для паровой стерилизации и 5 минут для стерилизации перекисью водорода, представлены как современные примеры передовой технологии быстрого считывания. Работа опирается на руководства FDA, стандарты серии ISO 11138, главы фармакопеи USP и рецензируемую литературу для контекстуализации преимуществ валидированных систем с сокращенным временем инкубации (RIT) для современного обеспечения стерильности.

---

Стерилизация — это валидированный процесс, используемый для того, чтобы сделать продукт свободным от всех форм жизнеспособных микроорганизмов, включая бактериальные эндоспоры (AAMI/ISO TIR 11139:2006). Эффективная работа стерилизаторов, используемых в медицинских учреждениях и на производстве, имеет решающее значение для предотвращения внутрибольничных инфекций и обеспечения безопасности пациентов. В рамках этой концепции биологические индикаторы служат наиболее прямым и окончательным методом оценки летальности, обеспечиваемой процессом стерилизации.

Биологический индикатор определяется как микробиологическая тест-система, обеспечивающая заданную устойчивость к определенному процессу стерилизации (AAMI, 2006). В отличие от химических индикаторов, которые реагируют на один или несколько физических или химических параметров процесса, БИ измеряют фактический микробицидный эффект, подвергая цикл стерилизации воздействию известной популяции высокорезистентных бактериальных спор. Выживание или инактивация этих организмов дает прямое доказательство того, были ли условия стерилизации достаточными для достижения желаемого уровня уничтожения микробов.

Эволюция от простых споровых полосок к системам автономных биологических индикаторов (АБИ) ознаменовала собой крупный прогресс в технологии мониторинга стерилизации. Современные АБИ, такие как производимые Terragene S.A., объединяют носитель со спорами и специально разработанную питательную среду в едином герметичном устройстве, обеспечивая четко определенные тестовые пределы, контролируемые условия восстановления, простую интерпретацию результатов и валидированное сокращенное время инкубации (RIT). Terragene дополнительно усовершенствовала эту технологию с помощью быстрых флуоресцентных индикаторов, способных выдавать подтвержденные биологические результаты всего за 7 секунд.

В данной статье представлен всесторонний обзор технологии БИ с акцентом на три области, имеющие особое значение для специалистов по стерилизации: 

• возможность быстрого считывания, обеспечиваемая конструкцией АБИ Terragene и технологией флуоресцентного обнаружения; 
• научная основа для демонстрации уровня гарантии стерильности (SAL) 10⁻⁶; 
• практические примеры того, как биологические индикаторы Terragene поддерживают и подтверждают обеспечение стерильности в различных режимах стерилизации.

---

НАУЧНАЯ ОСНОВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ

Биология спор и выбор организмов-индикаторов

Бактериальные эндоспоры являются краеугольным камнем технологии биологических индикаторов. 

Споруляция — это стратегия выживания, запускаемая дефицитом питательных веществ, в результате которой образуется покоящаяся клеточная форма, проявляющая исключительную устойчивость к таким стрессовым факторам окружающей среды, как тепло, химические агенты и радиация.

Эта устойчивость в сочетании со способностью оставаться стабильной во время длительного хранения и надежно прорастать при восстановлении благоприятных условий делает бактериальные споры идеально подходящими для мониторинга процессов стерилизации (Ridgeway, 2013).

Виды, наиболее широко используемые при производстве БИ, принадлежат к родам Bacillus, Geobacillus и Clostridium — все это грамположительные палочковидные бактерии. Для установленных процессов стерилизации международные стандарты (серия ISO 11138) и фармакопейные справочники (USP) рекомендуют следующие пары «организм — процесс»:

Таблица 1. Рекомендуемые организмы-индикаторы по процессам стерилизации

Процесс стерилизации	Организм-индикатор	Продукты Terragene Bionova®
Пар (автоклав)	Geobacillus stearothermophilus	BT225, BT224, BT222
Этилен Оксид (ЭО)	Bacillus atrophaeus	BT110
Сухожар	Bacillus atrophaeus	BT30
Перекись водорода (H₂O₂)	Geobacillus stearothermophilus	BT98, BT96
Формальдегид (LTSF)	Geobacillus stearothermophilus	BT102

Источник: адаптировано из руководства FDA CDRH (2007), серии ISO 11138 и USP <1035>

Geobacillus stearothermophilus является преобладающим организмом для мониторинга паровой стерилизации и стерилизации перекисью водорода. Это термофильный организм с оптимальным диапазоном температур роста 55–60°C. Для паровых БИ, соответствующих ISO 11138-3, минимальное D-значение должно составлять ≥ 1,5 минуты при Z-значении ≥ 6°C. Bacillus atrophaeus, мезофильный организм (оптимум 30–39°C), является референтным видом для стерилизации ЭО и сухим жаром, с минимальными D-значениями, указанными в ISO 11138-2 и ISO 11138-4 соответственно.

D-значение, Z-значение и кривая выживаемости

Эти параметры не являются просто академическими; они являются математической основой для расчета уровня гарантии стерильности и для проектирования циклов стерилизации, обеспечивающих требуемый запас прочности. FDA рекомендует определять D-значения на конечном готовом продукте с использованием резистометра, соответствующего стандартам ANSI/AAMI, и проводить испытания по крайней мере на трех различных партиях спор, полученных из разных урожаев спор (FDA CDRH, 2007).

ТЕХНОЛОГИЯ БЫСТРОГО СЧИТЫВАНИЯ В АБИ TERRAGENE

Преимущество автономного биологического индикатора

Автономные биологические индикаторы представляют собой фундаментальное конструктивное усовершенствование по сравнению с традиционными системами со споровыми полосками. В АБИ носитель со спорами и специально разработанная питательная среда заключены в едином герметичном блоке. После воздействия стерилизации пользователь активирует устройство (обычно раздавливая внутреннюю ампулу для высвобождения среды) и инкубирует его при валидированной температуре. Эта конструкция с замкнутой системой исключает риск постэкспозиционного загрязнения окружающей среды, стандартизирует условия восстановления и гарантирует, что каждый пользователь оценивает БИ в одних и тех же контролируемых параметрах, которые были валидированы производителем.

Автономные биологические индикаторы Terragene Bionova® включают хромогенные индикаторы pH в питательной среде для моделей с обычным считыванием и передовое ферментативное флуоресцентное обнаружение в линейках быстрых флуоресцентных продуктов. Во время инкубации метаболическая активность выживших спор производит либо кислые побочные продукты, вызывающие видимое изменение цвета, либо флуоресцентные субстраты ферментов, обнаруживаемые авто-ридером Bionova®. Флуоресцентный подход обеспечивает однозначный положительный/отрицательный результат со значительно более быстрой обработкой, что делает систему идеально подходящей для высокопроизводительных центральных стерилизационных отделений (ЦСО) и фармацевтических производств.




Новый 7-секундный АБИ (Bionova® BT225) от Terragene работает иначе. Этот БИ функционирует за счет использования структурных свойств белков спор. Споры, используемые в индикаторе, содержат высокостабильные белки со специфическими конформациями, устойчивыми к процессам стерилизации. При воздействии эффективных условий стерилизации эти белковые структуры подвергаются денатурации и необратимым конформационным изменениям. Эта потеря нативной структуры напрямую коррелирует с инактивацией спор, и BT225 обнаруживает этот переход как показатель летальности, обеспечивая быстрое и надежное указание на то, что процесс стерилизации достиг требуемого уровня уничтожения микробов.

Сокращенное время инкубации: принципы и валидация

Одним из наиболее клинически и операционно значимых атрибутов современных АБИ является их валидированное сокращенное время инкубации (RIT). В то время как обычный период инкубации для биологических индикаторов составляет 7 дней (как указано в ISO 11138-1, раздел 7.3), производители АБИ могут валидировать более короткие периоды инкубации при условии соблюдения строгих критериев.

В руководящем документе FDA CDRH «Предварительные уведомления [510(k)] о биологических индикаторах (БИ)» (2007) установлена методология валидации сокращенного времени инкубации. Протокол требует подвергнуть воздействию частичных циклов стерилизации, которые обеспечивают выживаемость спор от 30% до 80%, минимум 300 БИ (по 100 из каждой из трех различных производственных партий). Все БИ инкубируются в течение полного 7-дневного референсного периода с ежедневной регистрацией результатов. Валидированное RIT — это наибольшее количество дней инкубации, необходимое для достижения ≥ 97% от общего 7-дневного количества положительных результатов в любой отдельной партии. Критически важно, что результаты не усредняются по партиям: самая консервативная партия определяет минимальное время инкубации.

Эта методология гарантирует, что даже в наихудших условиях, когда только одна спора выживает после окололетального воздействия процесса, валидированного времени инкубации достаточно для того, чтобы этот последний выживший пророс, размножился и дал обнаруживаемый положительный сигнал в системе АБИ.

Портфолио быстрого считывания Terragene Bionova®

Terragene разработала комплексное портфолио автономных биологических индикаторов Bionova® с валидированным временем считывания, охватывающим замечательно широкий диапазон: от рекордных 7 секунд для паровой стерилизации до 4 часов для окиси этилена. Этот спектр скоростей считывания позволяет специалистам по стерилизации выбирать продукт, наилучшим образом соответствующий их операционному темпу, типу процесса и нормативным требованиям.

Таблица 2. Портфолио АБИ Terragene Bionova®: валидированное время считывания по продуктам и процессам стерилизации

Код продукта	Процесс стерилизации	Валидированное считывание	Обнаружение	Обычное время
BT225	Пар (влажное тепло 132-135°C)	7 секунд	Флуоресценция	7 дней
BT224	Пар (влажное тепло 132-135°C)	20 минут	Флуоресценция	7 дней
BT222	Пар (влажное тепло 121-135°C)	1 час	Флуоресценция	7 дней
BT98	Перекись водорода (H₂O₂)	5 минут	Флуоресценция	7 дней
BT96	Перекись водорода (H₂O₂)	30 минут	Флуоресценция	7 дней
BT110	Окись этилена (ЭО)	4 часа	Флуоресценция	7 дней
BT102	Формальдегид (LTSF)	2 часа	Флуоресценция	7 дней

Примечание: Все времена считывания валидированы в соответствии с методологией руководства FDA CDRH 510(k). Для флуоресцентного обнаружения требуется использование соответствующего авто-ридера Bionova.

Клиническое и операционное значение быстрого считывания

BT225 с его 7-секундным считыванием для паровой стерилизации представляет собой самый быстрый результат биологического индикатора, доступный в отрасли. Эта почти мгновенная обратная связь фундаментально трансформирует рабочий процесс в высокопроизводительных центральных стерилизационных отделениях: вместо того чтобы задерживать обработанные загрузки на часы или дни в ожидании результатов БИ, учреждения могут получить окончательное биологическое подтверждение эффективности стерилизации в течение секунд после начала инкубации. BT224 (20-минутное считывание) и BT222 (1-часовое считывание) предлагают промежуточные варианты, которые балансируют скорость с соображениями стоимости для учреждений с разными операционными потребностями.

Для стерилизации перекисью водорода, все более критически важного режима для термочувствительных устройств, BT98 обеспечивает подтвержденный биологический результат всего за 5 минут. BT96 с 30-минутным считыванием предлагает альтернативу для применений, где приемлемо немного более длительное окно.

Индикатор для стерилизации ЭО BT110 выдает результаты за 4 часа, по сравнению с обычной 48-часовой или 7-дневной инкубацией, обеспечивая более быстрое высвобождение загрузок, стерилизованных ЭО. Индикатор для формальдегида BT102 обеспечивает 2-часовое считывание для процессов LTSF, поддерживая быструю обработку в учреждениях, использующих низкотемпературную паровую и формальдегидную стерилизацию.

Как описано McCauley (2009), скорость обнаружения положительного сигнала в обычном АБИ напрямую связана с количеством выживших спор: непроэкспонированный контрольный БИ с полной популяцией спор обычно показывает положительный рост в течение 3-4 часов с использованием колориметрических методов. Технология флуоресцентного обнаружения Terragene сжимает этот временной масштаб на порядки, выявляя ферментативные маркеры жизнеспособности спор в концентрациях, значительно ниже порога, необходимого для видимого изменения цвета. Это технологическая основа, обеспечивающая времена быстрого считывания, показанные в таблице 2.

Для медицинских учреждений практическое влияние является преобразующим: с BT225 биологическое подтверждение стерилизационных загрузок может быть получено в течение секунд после обработки. Даже продукты с более длительным считыванием в портфолио обеспечивают высвобождение в тот же день. Это значительно улучшает доступность инструментов, снижает потребности в запасах, ускоряет планирование хирургических операций и устраняет операционное бремя управления протоколами отзыва загрузок, выпущенных до того, как стали доступны результаты обычных БИ.